Linhagem de camundongos clonados chega ao fim após 58 gerações com o acúmulo de alterações prejudiciais no DNA

Experimento de 20 anos chega ao limite

Após 30.947 tentativas de transferência nuclear e mais de 1.200 camundongos clonados, descendentes de uma única fêmea, uma equipe de pesquisa japonesa chegou ao fim de um experimento que durou cerca de 20 anos. Os cinco camundongos nascidos na geração 58 morreram no dia seguinte, encerrando uma linhagem que os pesquisadores acreditavam que poderia continuar indefinidamente.

O experimento, realizado de 2005 a 2025, constatou que a clonagem repetida permitiu o acúmulo de alterações prejudiciais no DNA. A taxa de sucesso dos nascimentos melhorou no início, passando de cerca de 7% na primeira geração para 15,5% na geração 26. A queda começou a partir da geração 27 e, por fim, a taxa chegou a 0,6%, o equivalente a cerca de seis nascimentos a cada 1.000 embriões clonados transferidos para mães de aluguel.

Os resultados foram publicados em Limitations of serial cloning, na revista Nature Communications. A Universidade de Yamanashi identificou a professora associada Sayaka Wakayama e o professor Teruhiko Wakayama, diretor de seu Centro de Biotecnologia Avançada, entre os pesquisadores mencionados em seu comunicado sobre a pesquisa.

O resultado mais revelador foi o contraste entre aparência e reprodução. Muitos camundongos da linhagem pareciam saudáveis e viveram cerca de dois anos, mas as gerações posteriores tiveram cada vez mais dificuldade para se reproduzir, tanto por clonagem quanto por acasalamento comum.

Teruhiko Wakayama, pioneiro da clonagem de camundongos na Universidade de Yamanashi, descreveu a questão por trás do experimento com uma comparação conhecida:

"Copiar uma imagem em uma fotocopiadora resulta em uma qualidade ligeiramente inferior. Fazer uma cópia dessa cópia reduz ainda mais a qualidade",

Nos camundongos, as alterações envolveram tanto letras individuais do DNA quanto segmentos muito maiores dos cromossomos. A pesquisa relaciona essas mudanças acumuladas à queda final nos nascimentos bem-sucedidos.

Como os pesquisadores clonaram um clone

A equipe usou a transferência nuclear de células somáticas. Uma célula somática é uma célula do corpo, e não um óvulo ou espermatozoide. Os pesquisadores removeram o núcleo, que contém a maior parte das instruções genéticas de uma célula, e o transferiram para um óvulo não fertilizado cujo próprio núcleo havia sido removido.

O óvulo precisou então reprogramar essas instruções para que o núcleo de uma célula adulta pudesse orientar o desenvolvimento de um embrião. Os pesquisadores transferiram os embriões resultantes para mães de aluguel e usaram células dos clones sobreviventes para criar a geração seguinte.

As células doadoras eram células do cúmulo, que envolvem e dão suporte aos óvulos. A doadora original era uma camundonga com pelagem aguti, uma coloração produzida por faixas de pigmento ao longo de cada pelo. Todos os camundongos clonados eram fêmeas e tinham essa cor de pelagem.

Os pesquisadores produziram cerca de três a quatro gerações por ano. Em vez de criar todos os camundongos diretamente a partir das células armazenadas da doadora original, eles transmitiram repetidamente a linhagem por um novo animal clonado. Esse desenho experimental permitiu acompanhar as alterações transmitidas de uma geração para a seguinte.

Por que os primeiros resultados pareciam promissores

O comunicado de março de 2013 do RIKEN descreveu um experimento que ainda avançava de forma animadora. Até o envio do artigo para publicação, a equipe havia produzido 581 camundongos ao longo de 25 gerações; até o comunicado, eram 598 em 26 gerações.

Os pesquisadores usaram tricostatina A, ou TSA, um medicamento que ajuda o núcleo transferido a reprogramar a atividade dos genes. Tentativas anteriores de clonagem repetida de camundongos haviam chegado a apenas cerca de seis gerações. Com a TSA e condições experimentais aprimoradas, a taxa de sucesso dos nascimentos aumentou, em vez de cair continuamente.

Naquela fase, as avaliações de saúde, fertilidade, longevidade e extremidades dos cromossomos também pareciam tranquilizadoras. Por isso, os pesquisadores acreditavam que o processo poderia continuar indefinidamente. O acompanhamento da mesma linhagem por mais uma década revelou problemas que não eram aparentes nas primeiras 25 gerações.

Os principais marcos mostram como a conclusão mudou:

• 2005: início da clonagem em série. O artigo final situa o começo em janeiro, enquanto o relato do RIKEN de 2013 o coloca no fim do ano.
• 8 de março de 2013: o RIKEN anunciou 598 camundongos ao longo de 26 gerações, com a taxa de sucesso dos nascimentos chegando a cerca de 15%.
• A partir da geração 27: a taxa de sucesso dos nascimentos começou a cair de forma sustentada, apesar das variações entre gerações.
• 2025: o experimento terminou na geração 58, depois que todos os cinco camundongos nascidos nessa geração morreram no dia seguinte.

O que mudou dentro do DNA?

O sequenciamento do genoma revelou cerca de 3.700 variantes de nucleotídeo único e 80 pequenas inserções ou deleções entre as gerações um e 57. Uma variante de nucleotídeo único, ou SNV, é uma alteração em uma letra da sequência de DNA. Uma inserção ou deleção acrescenta ou remove um pequeno trecho dessa sequência.

O artigo calculou médias de 69,4 SNVs e 1,4 pequenas inserções ou deleções por geração. Muitas alterações no DNA têm pouco efeito, mas algumas interferem nas instruções necessárias ao desenvolvimento ou à reprodução normais.

Para comparação, os pesquisadores analisaram duas linhagens de camundongos mantidas por 60 gerações de cruzamentos entre irmãos ao longo de cerca de 20 anos. Essas linhagens acumularam, em média, 22,3 SNVs por geração. Portanto, a taxa da linhagem clonada foi cerca de 3,1 vezes maior, com base na comparação entre 69,4 e 22,3.

Também aumentou a proporção de pequenas variantes que, segundo as previsões, prejudicariam ou alterariam proteínas. Ela passou de 0,52% entre as alterações surgidas da geração um à 23 para 1,19% entre as surgidas da geração 23 à 57.

Os pesquisadores também reconstruíram a árvore genealógica dos camundongos com base no DNA. Ela correspondeu à linhagem experimental registrada, confirmando que, ao longo de todo o experimento, os animais continuaram descendendo da doadora original.

Alterações maiores nos cromossomos aumentaram o impacto

Os camundongos acumularam mais do que alterações em letras individuais do DNA. O sequenciamento identificou cerca de 80 a 84 novas variantes estruturais entre as gerações um e 57, ou seja, alterações maiores na organização ou na quantidade de DNA.

Dezesseis variantes grandes envolveram segmentos de pelo menos 40.000 letras de DNA. Entre as alterações estavam a perda de um cromossomo X, uma mudança importante no cromossomo quatro e uma troca de material entre os cromossomos sete e nove.

Na geração 57, os pesquisadores estimaram que cerca de 30 mutações causavam perda da função de genes e aproximadamente 50 alteravam as instruções para proteínas codificadas pelos genes, mesmo sem contar a perda de um cromossomo X. Duas grandes deleções também afetaram a mesma região e eliminaram a função das duas cópias de um gene chamado Csmd1.

Os autores relacionam a queda na taxa de nascimentos ao impacto combinado das mutações. Segundo a explicação deles, novas alterações prejudiciais perto do fim do experimento levaram um genoma já bastante alterado além do limite que os camundongos em desenvolvimento conseguiam tolerar.

A origem da maior taxa de mutação ainda não foi esclarecida. A transferência repetida de núcleos de células somáticas pode contribuir, e células do corpo podem acumular mutações durante a vida de um animal. A ausência da reprodução sexual comum também altera a forma como essas mutações são transmitidas entre as gerações.

Por que reprogramar a atividade dos genes não bastou

A clonagem exige mais do que transferir DNA para um óvulo. O óvulo também precisa reprogramar marcas químicas que ajudam a determinar quais genes estão ativos. Essas marcas são chamadas de epigenéticas porque regulam o uso do DNA sem alterar sua sequência.

Os pesquisadores suspeitavam que falhas nesse processo de reprogramação pudessem piorar a cada rodada de clonagem. No entanto, as medições apontaram para o acúmulo de mutações no DNA como a principal explicação para a queda posterior.

Os camundongos clonados tinham placentas aumentadas, uma característica conhecida da clonagem de camundongos. Ao longo do experimento, as placentas pesaram, em média, cerca de 0,30 grama, em comparação com 0,11 grama nos controles produzidos por fertilização in vitro. O peso, porém, não continuou aumentando a cada geração.

Os testes de várias marcas epigenéticas em embriões iniciais também mostraram padrões bastante semelhantes nos clones recém-produzidos e nos clones da geração 51. A TSA continuou ajudando: a taxa de sucesso dos nascimentos na geração 51 foi de 5,4% com o tratamento, em comparação com 1,6% sem ele.

Os telômeros, sequências protetoras de DNA nas extremidades dos cromossomos, eram outra possível explicação. As análises de sequenciamento posteriores encontraram poucas evidências de encurtamento substancial nas gerações examinadas. Em conjunto, os testes voltaram a atenção para o acúmulo de alterações na sequência do DNA e na estrutura dos cromossomos.

Camundongos com aparência saudável tiveram menos filhotes

O acasalamento comum revelou uma queda na reprodução que era difícil perceber pela aparência dos camundongos. Fêmeas da geração 20 tiveram, em média, 9,9 filhotes por ninhada quando acasaladas com machos normais, número próximo dos 10,3 registrados no grupo de controle.

O tamanho médio das ninhadas caiu para 2,8 filhotes na geração 50 e 2,2 na geração 55. Este último valor foi cerca de 79% inferior à média do grupo de controle, calculada com base na comparação entre 2,2 e 10,3 filhotes.

O número de óvulos coletados após estimulação hormonal não diminuiu à medida que as gerações de clones avançaram. Por isso, os pesquisadores examinaram o que acontecia com os óvulos após sua ativação ou fertilização.

Quando foram fertilizados em laboratório com espermatozoides de machos normais, 97,6% dos embriões do grupo de controle chegaram ao estágio de blastocisto, uma fase inicial anterior à implantação. A proporção foi de 39,7% para óvulos de clones da geração 25 e de 20,3% para óvulos da geração 53.

Experimentos com óvulos da geração 56 encontraram problemas tanto no núcleo quanto no citoplasma, o material ao redor dele. Mesmo a substituição de qualquer um desses componentes pelo correspondente de um óvulo do grupo de controle resultou em taxas de desenvolvimento muito baixas. Ambos os componentes do óvulo pareciam comprometidos.

A reprodução sexual recuperou parte da fertilidade

Alguns descendentes de clones das gerações finais sobreviveram e se reproduziram com mais sucesso. Embora as fêmeas clonadas da geração 55 tivessem, em média, 2,2 filhotes por ninhada, seus descendentes tiveram depois ninhadas com média de 7,0 filhotes, mais que o triplo.

As placentas desses netos também tinham tamanho próximo ao das placentas de embriões produzidos por fertilização, em vez do aumento típico dos camundongos clonados.

A reprodução sexual reorganiza o material genético durante a formação dos óvulos e espermatozoides e combina esse material com o DNA de outro progenitor na fertilização. Uma cópia funcional de um gene herdada de um progenitor às vezes pode compensar uma cópia danificada herdada do outro. Embriões com problemas genéticos graves podem parar de se desenvolver, enquanto aqueles com combinações viáveis sobrevivem.

Os descendentes ainda herdaram mutações das fêmeas clonadas. O sequenciamento do genoma encontrou variantes tanto nos filhos quanto nos netos, incluindo a troca entre os cromossomos sete e nove. Os pesquisadores sugeriram que os dois cromossomos alterados foram herdados juntos, mantendo a troca equilibrada.

Portanto, o aumento no tamanho das ninhadas indica uma recuperação reprodutiva parcial por meio da reprodução sexual. Os descendentes conseguiram se reproduzir melhor, embora continuassem carregando algumas das alterações genéticas acumuladas durante a clonagem.

O que isso significa para a conservação e a criação de animais

A clonagem interessa a conservacionistas porque células armazenadas podem preservar material genético de animais mortos ou incapazes de se reproduzir. Na pecuária, ela oferece uma forma de reproduzir animais com características valorizadas. O experimento mostra por que essas aplicações exigem atenção às condições do DNA doador e à saúde reprodutiva dos descendentes.

O resultado diz respeito à clonagem repetida ao longo de uma longa cadeia de doadores sucessivos. Cinquenta e oito gerações representam o limite desta linhagem específica de camundongos nas condições experimentais adotadas; não se sabe quantas gerações seriam possíveis em outras linhagens ou espécies de mamíferos.

Katarzyna Malin, endocrinologista do desenvolvimento da Universidade da Califórnia em Davis, que não participou da pesquisa, afirmou que os resultados favorecem a conservação que evita que as espécies cheguem a uma situação crítica, em vez de depender da clonagem para salvá-las depois.

Ben Novak, da organização de conservação Revive & Restore, destacou a importância das mutações que se acumulam nos tecidos do corpo ao longo da vida de um animal. Uma célula doadora carrega seu próprio histórico de alterações no DNA, algo relevante quando essa célula se torna o ponto de partida para outro animal.

O estudo reúne duas lições práticas. A clonagem pode preservar o acesso ao material genético de um animal por muitas gerações, mas a saúde dos descendentes também depende do que acontece com esse DNA ao longo do tempo. Neste experimento, o acasalamento comum permitiu que alguns descendentes recuperassem parte da fertilidade depois que a linhagem de clonagem se aproximou do fim.

Principais pontos

• Os pesquisadores fizeram 30.947 tentativas de transferência nuclear e produziram mais de 1.200 camundongos a partir de uma fêmea original, por meio de clonagens sucessivas.
• A taxa de sucesso dos nascimentos chegou ao pico de 15,5% na geração 26 e depois caiu para 0,6% perto do fim do experimento.
• Todos os cinco camundongos da geração 58 morreram no dia seguinte ao nascimento, encerrando a linhagem em 2025.
• A linhagem clonada acumulou cerca de três vezes mais alterações em letras individuais do DNA por geração do que as linhagens de comparação mantidas por cruzamentos entre irmãos.
• Mutações prejudiciais no DNA e grandes alterações cromossômicas se acumularam, enquanto as anormalidades epigenéticas medidas não pioraram progressivamente.
• A reprodução sexual melhorou a fertilidade de alguns descendentes, embora as mutações herdadas tenham permanecido.